:: Главная :: Нормативные документы :: Методы :: Объекты :: Сотрудники :: Конференции и события :: Публикации ::
:: Преподавательская деятельность :: Образовательные проекты :: Биотестирование в вопросах и ответах ::
Составитель - Анна Петросян
Этот раздел на нашем сайте появился в связи с тем, что многие вопросы очень
часто повторяются. Их задают нам школьники и студенты, преподаватели биологии
и слушатели научно-практических семинаров, работники природоохранных органов,
простые любители природы.
Просмотрите этот раздел и, возможно, вы сами найдете готовый ответ на свои вопросы.
При использовании материалов раздела, пожалуйста, указывайте ссылку на первоисточник.
Если вы только начинаете заниматься биотестированием и у вас появляются вопросы,
пишите нам и мы постараемся ответить
вам.
Под
биотестированием (bioassay)
обычно понимают процедуру установления токсичности среды с помощью тест-объектов,
сигнализирующих об опасности независимо от того, какие вещества и в каком сочетании
вызывают изменения жизненно важных функций у тест-объектов.
Благодаря простоте, оперативности и доступности биотестирование получило широкую
признание во всем мире и его все чаще используют наряду с методами аналитической
химии. Фото А.Петросян
2. Для чего используется биотестирование?
Биотестирование как метод оценки токсичности водной среды используется:
Тест-объект
(test organism) - организм, используемый при оценке
токсичности химических веществ, природных и сточных вод, почв, донных отложений,
кормов и др.
Тест-объекты, по определению Л.П.Брагинского - "датчики" сигнальной
информации о токсичности среды и заменители сложных химических анализов, позволяющие
оперативно констатировать факт токсичности (ядовитости, вредности) водной среды
("да" или "нет"), независимо от того, обусловлена ли она
наличием одного точно определяемого аналитически вещества или целого комплекса
аналитически не определяемых веществ, какой обычно представляют собой сточные
воды. Тест-объекты с известной степенью приближения дают количественную оценку
уровня токсичности загрязнения водной среды - сточных, сбросных, циркуляционных
и природных вод. Фото А.Петросян
4. Какие тест-объекты используются для биотестирования?
Для биотестирования используются различные гидробионты - водоросли, микроорганизмы, беспозвоночные, рыбы. Наиболее популярные объекты - ювенальные формы (juvenile forms) планктонных ракообразных-фильтраторов Daphnia magna, Ceriodaphnia affinis. Cемидневный тест на суточной молоди цериодафнии Ceriodaphnia affinis позволяет за более короткий срок (7 сут), чем на Daphnia magna (21 сут) дать заключение о хронической токсичности воды.
Важное условие правильного проведения биотестирования - использование генетически однородных лабораторных культур, так как они проходят поверки чувствительности, содержатся в специальных, оговоренных стандартами лабораторных условиях, обеспечивающих необходимую сходимость и воспроизводимость результатов исследований, а также максимальную чувствительность в токсическим веществам. Фото А.Петросян
5. Что служит основанием для выбора тест-объекта при проведении биотестирования?
Стандартные методики, регламентированные нормативными документами, определяют тест-объекты, которые используются при определении токсичности тех или иных сред. В Украине в качестве стандартных приняты тесты с ветвистоусыми и жаброногими ракообразными, водорослями, инфузориями, светящимися бактериями.
6. Что такое токскит (TOXKIT®)?
Новое поколение биотестов, разработанных в лаборатории экологической токсикологии и водной экологии (LETAE), Университет Гент, Бельгия под руководством проф. G. Persoone (http://www.microbiotests.be/). Токскиты предназначены для проведения исследований острой токсичности природных сред и содержат все обходимые материалы для выполнения биотестирования или экотоксикологических исследований (тест-организмы в анабиотическом состоянии, эфиппиумы дафний (resting eggs), покоящиеся яйца коловраток, яйца артемии, культуры водорослей). Toxkit® реализуются вместе со всеми необходимыми приспособлениями, посудой и средами культивирования. Фото
А.Петросян
7. Что такое тест-функция (test function)?
Жизненная функция или критерий токсичности (toxicity
criterion), используемые в биотестировании для характеристики отклика
тест-объекта на повреждающее действие среды.
Тест-фукнкции, используемые в качестве показателей биотестирования для различных
объектов:
8. Как долго длится биотестирование?
Длительность биотестирования зависит от задачи, поставленной исследователем.
Острые биотесты (acute tests),
выполняемые на различных тест-объектах по показателям выживаемости, длятся от
нескольких минут до 24-96 ч.
Краткосрочные (short-term
chronic tests) хронические тесты длятся в течение 7 суток и заканчиваются,
как правило, после получения первого поколения тест-объектов.
Хронические тесты (chronic
tests) на общую плодовитость ракообразных, охватывающие 3 поколения,
длятся до рождения молоди в F3.
9. Что такое токсический эффект?
Токсический эффект (toxic
effect) - изменение любого показателя жизнедеятельности или функций организма
под воздействием токсиканта. Зависит от особенностей яда, специфики метаболизма
организма, факторов внешней среды (содержание кислорода, рН, температуры и др.).
10. Что такое токсичность среды и как она определяется?
Токсичность (toxicity)
- cвойство химических веществ проявлять поверждающее или летальное действие
на живые организмы. Вещество, оказывающее токсическое дейтствие, называется
токсикантом, а процесс воздействия токсиканта на организм - токсикацией (на
экосистему - токсификацией). По Н.С.Строганову, количественно токсичность вещества
для отдельного организма определется как величина, обратная медианной летальной
концентрации: Т = 1/LC50.
Токсичность водной среды (toxicity of water environment) - токсичность воды и донных отложений для гидробионтов, возникающая вследствие появления в ней токсических веществ природного или антропогенного происхождения (ксенобиотиков), загрязнения сточными водами, токсическими атмосферными осадками и пр. При возникновении токсичности водной среды вода из среды, поддерживающей жизнь, становится средой, губительной для жизни. Степень токсичности водной среды оценивается методами биотестирования, а также по превышению ПДК (предельно допустимых концентраций).
11. Какая разница между острой и хронической токсичностью?
Острая токсичность выражается в гибели отравленного организма за короткие промежуток времени - от нескольких секунд до 48 ч. Хроническая токсичность среды проявляется через некоторое время в виде нарушений жизненных функций организмов и возникновения патологических состояний (токсикозов). У водных организмов хроническая токсичность выражается в гонадотропном и эмбриотропном действии токсиканта, что приводит к нарушению плодовитости (продуктивности), эмбриогенеза и постэмбрионального развития, возникновению уродств (мутаций) в потомстве, сокращению продолжительности жизни, появлению "карликовых" форм.
12. Что такое интегральная токсичность и как она определяется?
Интегральная токсичность (integral toxicity), по определению Л.П.Брагинского, токсичность сложных смесей, сточных вод, многокомпонентных факторов для водных организмов.
Количественно интегральная токсичность определяется как величина, обратная максимальному разведению (1:2, 1:5, 1:10, 1:50, 1:100 и т.д.), при котором не наблюдается каких-либо нарушений жизненно важных функций тест-организмов при 24-48 часовом биотестировании.
Выражается в баллах токсичности (БТи) целыми числами (2, 5, 10, 50, 100 и т.д.) соответственно величинам разведения.
Баллы токсичности могут быть четко ранжированы и позволяют выстраивать ряд исследуемых веществ или вод по снижению (повышению) уровня их токсичности.
13. Что такое толерантность организма?
Толерантность (tolerance)
- выносливость (устойчивость) организма к повреждающим воздействиям.
Диапазон толерантности - пределы
колебаний концентраций токсических веществ, при которых не происходит нарушений
функций организма.
Толерантный лимит (tolerance
limit, TLm) - количественное выражение концентрации токсиканта, при которой
гибнет или выживает 50% тест-организмов за 48 ч опыта.
14.Что такое токсикорезистентность организма?
Токсикорезистентность (toxin resistance)- сопротивляемость живых организмов к воздействию токсических веществ.
15. Что такое токсобность среды?
Токсобность (toxobity) - способность водных организмов существовать в токсической среде, сорбируя или используя определенное количество токсического вещества.
Токсикометрия (toxicometry) совокупность приемов оценки токсичности веществ. Основними приемами токсикометрии являются установление минимально переносимой или пороговой (threshold concentration) концентрации (LC0), медианной летальной концентрации (LС50), или дозы (LD50), и зоны токсического действия (toxic effect limits) - диапазона токсических концентраций - от LC0 до абсолютно летальной (LC100).
Биомаркеры – это организмы и их характеристики, которые позволяют диагностировать текущее состояние окружающей среды. В качестве характеристик могут выступать физиологические, биохимические, иммунологические и другие свойства (процессы) организмов.
Биоиндикация (bioindication) – метод определения качества среды обитания организмов по видовому составу и показателям количественного развития видов биоиндикаторов и структуре образуемых ими сообществ.
Биоиндикатор (bioindicator) – организм, вид, популяция, сообщество, характеризующиеся специфическими особенностями обитания или указывающие на специфические изменения условий среды (Семенченко, 2004).
Биоиндикаторы делят на следующие группы:
Биоиндикаторы загрязнения (bioindicators of contamonation) - 1) организмы, которые поглощают (накапливают) токсические вещества и способны в силу этого быть показателями загрязненности воды данным веществом; 2) организмы, свидетельствующие о загрязненности воды. По набору таких организмов в водоеме судят о качестве воды (Кузьменко и др., 1999).
В отличие от биомаркеров, биоиндикаторы не могут мгновенно реагировать на изменение экологических условий, т.к. их индикаторными свойствами являются популяционные процессы и процессы в сообществе в целом. Основным преимуществом биоиндикаторов перед биомаркерами является тот факт, что далеко не всегда кратковременное изменение условий, на которое реагирует биомаркеры, приводит к негативным изменениям в популяциях, сообществах и экосистемах (Семенченко, 2004).
20. Как правильно выбрать биоиндикаторы?
В странах ЕС при биоиндикации водных объектов, в основном, используются наиболее чувствительные организмы бентоса. Численность толерантных видов уменьшается по мере увеличения степени загрязнения. К таким видам относятся личинки насекомых отрядов Ephemeroptera, Trochoptera, Plecoptera.
21. Что такое биотический индекс?
Биотические индексы – это интегрированные показатели состояния условий среды, рассчитанные на основании балльной оценки различных биоиндикаторов.
22. Существуют ли количественные меры токсичности веществ для живых организмов?
Да, такие величины существуют. Это показатели острой токсичности
NOEC, LC0, LC50, LC100, устанавливаемые для "чистого" вещества при
его лабораторном исследовании. Показатели не имеет универсального значения и
устанавливается для каждого тест-объекта индивидуально.
NOEC - no observed effect
concentration - максимально недействующая концентрация вещества;
LC0 - минимальный порог чувствительности, при котором
отмечаются специфические тест-реакции или смертность тест-объектов;
LC50 - cтандартная мера токсичности вещества, показывающая,
какая концентрация вещества вызывает гибель 50% тест-организмов за установленное
время (24, 48 или 96 ч)
LC100 - высший смертельный порог для всех животных
или тест-культуры водорослей, использованных в опыте.
23. Можно ли содержать тест-объекты в домашних условиях?
Можно,
но для правильного содержания лабораторных животных необходимы стандартизованные
лабораторные условия, оговоренные в соответствующих методических руководствах
по проведению анализов. В случае несоблюдения основных требований содержания
тест-объекты могут изменить чувствительность и в этом случае данные исследований
будут носить только любительский характер. В соответствии с требованиями нормативных
документов, исследования качества природных сред проводятся на базе аттестованных
лабораторий, обладающих необходимым набором поверенных приборов, реактивов и
квалифицированным персоналом. Фото А.Петросян
24. Можно ли использовать биотестирование вместо химического анализа на содержание загрязняющих веществ?
Биотестирование, как правило, используют до химического анализа, т.к. этот метод позволяет провести экспресс-оценку природной среды и выявить"горячие точки", указывающие на наиболее загрязненные учаскти акватории (территории, полигона). На участках, где методами биотестирования выявлены какие-либо отклонения и исследуемая среда характеризуется как токсичная, аналитическим путем необходимо установить причины этого явления.
25. Можно ли по реакции тест-объектов обнаружить зоны экологического бедствия или источники загрязнения?
Да. На наиболее загрязненных акваториях (территориях) тест-объекты демонстрируют минимальную выживаемость (плодовитость) в тестируемых средах, на основании чего делается вывод об острой (хронической) токсичности тестируемой среды. Токсикометрические показатели, используемые в биотестиоровании, позволяют картировать загрязненные районы.
26. Существуют ли специфические реакции тест-объектов на специфические виды загрязнения?
Как правило, биотестирование не дает ответа на вопрос о характере загрязняющего вещества, вызывавшего ту или иную реакцию тест-объекта. Тест-функции в биотестировании носят общий, неспецифический характер. Однако количество загрязняющих веществ, попадающих в окружающую среду, неуклонно возрастает и не исключено, что какое-либо вещество, или смесь веществ, может привести к возникновению специфических реакций у тест-объектов, особенно на клеточном или тканевом уровнях организации.
27. Можно ли методами биотестирования оценить токсичность питьевой воды?
Можно. Для этих целей наиболее подходящим можно считать тест на инфузориях (Tetrachymena pyriformis).
28. Если в водоеме есть ракообразные или одноклеточные водоросли, значит ли это, что вода не токсична?
Нет, присутствие в водоеме живых организмов еще не означает, что в нем способны выживать и другие виды организмов, или некоторые, особенно чувствительные их стадии развития. Иногда в водоемах наблюдают явление "цветения" одноклеточных водорослей, некоторые из которых выделяют токсические продукты жизнедеятельности - метаболиты, вызывающие гибель других видов водорослей, ракообразных, рыб.
29. Можно ли, используя мотоды биотестирования, определить, загрязнена ли почва?
Существует два методических подхода для определения токсичности почв. Для экспресс-диагностики используют водные экстракты, содержащих водорастворимые фракции почв. В этом случае биотестирование выполняют на традиционных для водной токсикологии тест-объектах - ракообразных, инфузориях, водорослях. При необходимости исследовать фитотоксические свойства почв в качестве тест-объектов используют семена культурных растений - овса, кресс-салата и др. В этом случает показателями токсичности служат энергия прорастания семян, морфометрические характеристики листа и др.
30. Можно ли, основываясь на данных биотестирования, предъявить штрафные санкции за ущерб окружающей среде?
Да. Результаты исследований токсичности сточных вод методами биотестирования используются при расчетах и корректировке предельно допустимых сбросов (ПДС) веществ, поступающих в водные объекты со сточными водами.
31.Как сохранить пробы воды и образцы грунтов или донных осадков, предназначенных для биотестирования?
Пробы воды установленного объема должны быть отобраны в чистую посуду c этикетками и помещены в холодильник с температурой 4°С. Образцы донных отложений или грунтов должны буть упакованы в полиэтиленовые мешки для проб, снабжены этикетками и помещены в холодильник с температурой 0-4°С.
32.Как долго можно хранить образцы до проведения исследований их токсичности?
Исследования проводят как можно быстрее, не позднее, чем через 6 часов после отбора проб. При невозможности соблюдения этих требований , пробы охлаждают до 4 Ос на месте отбора. В этом случае анализ проводят не позднее, чем через 48 часов после отбора.
При отсутствии возможности исследований в течение 48 часов, пробу можно сохранять в замороженном состоянии 2 месяца.
33.Можно ли использовать массовые виды организмов, собранных в природе, в качестве тест-объктов?
Массовые виды организмов можно использовать для первичной оценки
острой токсичности среды, а также для введения в лабораторную культуру необходимых
для экспериментов животных. Однако необходимо помнить, что организмы, взятые
в природных водоемах, генетически неоднородны, часто и обитают в загрязненных
водоемах и адаптированы к различным загрязняющим веществам. Для корректного
использования таких организмов в качестве тест-объектов для биотестирования
следует, как минимум, провести их акклимацию в стандартных лабораторных условиях.
Оптимальным подходом можно считать более длительный и сложный,
но оправданный путь - получения достаточного для экспериментов количества потомства
во втором и последующих поколениях. У ветвистоусых ракообразных, например, потомство
от одной партеногенетической самки может дать начало новой лабораторной культуре.
34. Где можно получить лабораторные культуры тест-объектов и консультацию по методам биотестирования?
В Украине генетически однородные культуры тест-объектов (водных беспозвоночных и водорослей) можно получить в специализированных научных учреждениях, аккредитованных в системе сертификации УкрСЕПРО на проведение анализов с использованием необходимого тест-объекта. Там же можно получить необходимые консультации и методические рекомендации по проведению исследований.
35. Где можно провести исследования токсичности природных сред с использованием методов биотестирования?
В Украине для выполнения исследований по определению показателей токсичности следует обращаться в лаборатории, аккредитованные в государственной системе сертификации УкрСЕПРО для выполнения необходимых видов исследований.
Свяжитесь с нами и мы поможем вам решить проблемы, связанные с определением токсичности токсичности природных, питьевой и сточной воды и донных отложений, почв, кормов и пр.
35. Было бы интересно узнать, какие новые разработки появились в области морского биотестирования?
В разделе Публикации группы биотестирования и биоиндикации на нашем сайте Вы можете познакомиться с основными публикациями нашей группы.
37. Какие культуры водорослей, кроме Phaeodactylum tricornutum, еще
можно использовать для биотестирования водной среды?
Для морских вод нормативным документом, принятым в Украине, кроме Phaeodactylum
tricornutum регламентирована еще и Skeletonema costatum. Этот же
вид водорослей рекомендуется стандартом ISO.
Для пресных вод используется Selenastrum capricornutum, Scenedesmus subspicatus
и Chlorella vulgaris.
Посмотреть нормативные документы
38. Где можно приобрести культуры тест-объектов вместе с методическими рекомендациями?
Наша
лаборатория располагает культурами пресноводных тест-объектов (Ceriodaphnia
affinis Lilljeborg, 1900, Daphnia magna Straus, 1820), покоящимися
стадиями морских тест-объектов (Artemia salina). Фото
А.Петросян
Специалисты лаборатории проводят обучающие семинары.
Возможны заочные консультации (Свяжитесь
с нами).
39. Кого из эндемиков или вселенцев растительного планктона или зоопланктона Каспийского моря можно использовать для биотестирования?
Можно использовать любые организмы для экотоксикологических исследований, однако распространенной ошибкой будет считать эти исследования биотестированием.
Для выполнения биотестирования используют только стандартные методы и применяют
их только к лабораторным тест-организмам, полученным в аттестованных лабораториях
или музейных коллекциях и культивируемым в стандартных условиях, оговоренных
в методиках. Ясно, что собранные в природе организмы не отвечают этим условиям.
Существует практика введения в культуры тест-объектов, рекомендованных нормативными
документами, из природных местообитаний. В этих случаях обязательными этапами
являются акклимация организмов к стандартными лабораторным условиям и проведение
их проверки на чувствительность к стандартному токсиканту. В случае, если культура
удовлетворяет требованиям, предъявляемым к стандартным тест-объектам, ее можно
содержать в музее культур и использовать для биотестирования.
40. Существуют ли стандартные культуры бентосных организмов для биотестирования морских вод и донных отложений?
В стандартах Украины и России рекомендованы универсальные тест-объекты, используемые
как для биотестирования воды, так и для биотестирования донных осадков. При
этом для биотестирования донных осадков готовят водные экстракты (вытяжки),
а тестирование происходит в жидкой фазе.
Известны зарубежные стандарты для биотестирования донных отложений морских,
солоноватоводных и пресноводных водоемов: морские бентосные амфиподы (Corofium
volutator), пресноводные и солоноватоводные хирономиды.
41. Можно ли использовать эндемиков Каспийского моря для проведения биотестирования?
Да, если Вы разработаете свой оригинальный метод на эндемике Каспийского моря
и пройдете сложный путь от подготовки метода и метрологических экспертиз, согласования,
утверждения до введения нового нормативного документа для оценки токсичности
природных сред Вашим методом.
42. Порекомендуйте литературу, регламентирующую четкие требования к организации работ по определению токсичности сточных вод методами биотестирования, требования к помещениям, вентиляции и т.д.
Четких рекомендаций по вентиляции помещений, конечно, нет. Однако, процедура проведения биотестирования на всех известных нам тест-объектах очень жестко регламентирует соблюдение стандартных условий, включая условия безопасного проведения работ.
В качестве требований к условиям правильного выполнения биотестирования относится
проведение работ в помещении без вредных испарений и газов при фиксированной
в определенном диапазоне температуре.
Мы советуем посметреть следующую литературу:
А также любые другие методические рекомендации по биотестированию, с которыми Вы можете познакомиться на нашем сайте.
43. Помогите, пожалуйста, написать диплом по биотестированию.
Мы не помогаем писать дипломы, курсовые, диссертации и конкурсные работы.
Мы консультируем по всевозможным вопросам, которые возникают у специалистов,
занимающихся биотестированием.
44. Можно ли проверять на токсичность фуражное зерно и на основе биотестирования выдавать заключения? И требуется ли аттестация специалиста лаборатории?
Можно, если это заключение устроит Вашего заказчика.
Существует документ, утвержденный Россией, Украиной и др. странами "Зерно
фуражное, продукты его переработки, комбикорма. Методы определения токсичности"
(ДСТУ 3570-97, ГОСТ 3496.7-97) по оценке токсичности зерна с использованием
инфузорий и млекопитающих. Для проведения работ нужна не только подтвержденная
аттестационными документами квалификация специалистов, нужна еще и аккредитация
самой лаборатории на проведение данных работ в системе Госстандарта.
45. Кем разработан тест на цериодафниях?
В 1984 г. в США Д. Маунтом и Т. Норбергом разработан 7-и суточный тест на цериодафниях. Для использования в СССР тест был адаптирован в лаборатории физиологии и токсикологии водных животных ИБВН РАН под руководством проф. Б.А.Флерова.
Почему тест-функцией при биотестировании является только гибель объектов, а измерение параметров движения не используется?
Гибель тест-объектов – это не единственный критерий токсичности. Существует достаточно много методов биотестирования, которые дают прекрасные результаты, но вытеснить выживаемость. а также плодовитость и качество потомства они не смогли. Показатель "выживаемость/смертность" , конечно, не самый чувствительный. Но с него обычно начинают оценку токсичности природных или морских вод. Более важным для водной экосистемы является критерий плодовитости и качества потомства. В биотестировании используется лабораторная культура партеногенетических самок, которые каждые 8-14 день рождают молодь, которая отличается от взрослых самок только размерами. Это позволяет изучать влияние отдельных веществ в ряде поколений, что очень важно для прогнозирования последствий попадания в водную среду тех или иных токсикантов.
Характеристики движения объектов не являются тест-функцией или не используются из-за отсутствия средств для измерения?
Тесты на движение ракообразных вполне имеют право на существование.
Этот же подход оценки характера движения тест-объектов реализован в приборе "Биотестер", в который вставляются кюветы с инфузориями, обладающих отрицательным геотаксисом в норме (метод Пожарова, г. Санкт-Петербург). Луч прибора регистрирует количество организмов в верхней части кюветы именно благодаря движению инфузорий, так как оптически они практически прозрачны.
Надо ли фильтровать биогенезированную воду или ее только отстаивают?
Биогенизированную воду (или контрольную воду) фильтровать и отстаивать не нужно.
Подготовлено по материалам
